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普拉特澤生物為廣大生命科學研究人員提供wb實驗，可根據(jù)實方案的要求選擇不同的檢測方法，本文就跟大家一起繼續(xù)探究跑磷酸化蛋白WB的硬核技巧有哪些~

1 實驗概述

蛋白質(zhì)磷酸化屬于蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在探究某條通路例如MAPK或者NF-κB通路的激活情況，利用蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)檢測相關(guān)蛋白質(zhì)（p-p38、p-p65、p-IκB）磷酸化的相對水平，可以分析細胞對于外界刺激的做出變化。而Western Blot檢測磷酸化蛋白通常會出現(xiàn)條帶模糊、或多雜帶等難點，存在許多需要注意的方面。因此，下面主要對跑磷酸化蛋白的難點進行分析和一些經(jīng)驗分享：

圖片來源：https://www.bioradiations.com/10-tips-for-western-blot-detection-of-phosphorylation-events/

2 磷酸化蛋白WB的難點

1. 細胞樣本的預(yù)處理

問題1：磷酸化狀態(tài)容易發(fā)生改變，通常地，當我們用裂解液裂解細胞之后，分離出包含磷酸化蛋白的總蛋白，但此時由于細胞內(nèi)環(huán)境的改變磷酸酶容易被激活，進一步導(dǎo)致磷酸化蛋白發(fā)生去磷酸化。
解決辦法：在細胞裂解時，除了添加蛋白酶抑制劑，裂解液還要按照比例添加磷酸酶抑制劑。

問題2：細胞受刺激后激活相關(guān)通路，促使蛋白發(fā)生磷酸化；此時磷酸化蛋白的含量相對而言是比較低的，如何獲取足夠的蛋白上樣量。
解決辦法：首先是保證蛋白的有效提取，將細胞和裂解液混合物收集至離心管后立即置于冰上裂解15min，然后用超聲細胞破碎儀充分裂解細胞。離心收集上清后，為了保證磷酸化的完整性和活性，一般現(xiàn)提現(xiàn)用，比普通蛋白的保存要求更高，因此上樣的蛋白盡量要新鮮。

2. 選擇性價比高的抗體

問題1：如何快速定位和選擇合適的抗體？
解決辦法：通過查閱文獻確定目的蛋白磷酸化位點或者直接通過已知文獻確定抗體的購買來源、選擇知名品牌或經(jīng)過驗證的磷酸化特異性抗體，比較磷酸化蛋白的效價如何。
另外，選擇性價比高的抗體，例如售后服務(wù)較好、可以試用、顯影條帶清晰、價格合適，通常磷酸化抗體比普通抗體而言可能會貴一點，可以選擇抗體有活動時購買。另外，針對磷酸化蛋白的抗體需要具有高度的特異性，能夠準確識別目標蛋白上特定的磷酸化位點；若存在特異性不好的情況，就可能與非磷酸化蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性。

3. 優(yōu)化膜的封閉和顯影

問題：封閉背景高，顯影時出現(xiàn)大片黑色或黑色小點；條帶不明顯、沒有條帶或者條帶彌散；條帶數(shù)量多不能準確定位蛋白位置。
解決辦法：對于磷酸化抗體來說5%BSA封閉液的封閉效果可能比5%的脫脂奶粉效果更好一些。通常實驗室購買的脫脂奶粉中可能會含有磷酸酶，孵育時就可能對磷酸化的蛋白產(chǎn)生降解。
由于磷酸化蛋白本身含量較低，因此要保證上樣量足夠、上樣蛋白新鮮，顯色時才能出現(xiàn)條帶，另外若是曝光時間足夠長（超過1min卻一點條帶都沒有）,就可能說明上述兩個問題。另外抗體本身效果不好、特異性差、封閉不好就會出現(xiàn)條帶數(shù)量多無法確定正確條帶的位置。

4. 分析條帶

問題：磷酸化蛋白到底是一個條帶還是兩個條帶，磷酸化是否是需要跑總蛋白，定量時如何分析。
解決辦法：條帶的數(shù)量取決于磷酸化位點的數(shù)量和狀態(tài)，因此在購買抗體時我們就要確定好磷酸化位點，若蛋白具有多個磷酸化位點，這些磷酸化蛋白在電泳時遷移率就可能不同，若是一個蛋白存在兩種不同的磷酸化形式且分離效果不一致此時就可能出現(xiàn)兩個條帶，相反就只有一個條帶。另外一種簡單的方法就是直接通過查閱文獻確定磷酸化位點和抗體購買來源，根據(jù)抗體說明書確定條帶數(shù)目。

通常地，磷酸化蛋白的檢測需要設(shè)置兩個內(nèi)參，一個是普通內(nèi)參例如常用的GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）或者β-actin（β-肌動蛋白）而另一個就是磷酸化蛋白對應(yīng)的總蛋白。普通內(nèi)參是作為實驗組的對照，保證上樣量一致的同時排除實驗本身的影響。例如分析PI3K/AKT通路，檢測AKT磷酸化蛋白的同時也需要檢測其總蛋白水平；因為僅僅檢測到其磷酸化蛋白表達量發(fā)生變化不能充分說明問題，此時需要比較磷酸化蛋白與總蛋白的比值，比值變化表達了磷酸化水平發(fā)生相對變化。

圖片來源：https://azurebiosystems.com/product/western-blot-box/

3 注意事項

（1）由于磷酸化蛋白的量相對較少，因此接種細胞時，要保證足夠的細胞數(shù)量6孔板一般1×10⁶~4×10⁶個/孔。

（2）超聲破碎時，要控制超聲的功率、時間間隔；超聲間歇可置于冰上降溫，避免長時間超聲造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞和磷酸化位點丟失。例如設(shè)置程序共計破碎次數(shù)：80~100次，破碎3s，停3s。1管細胞破碎20次左右，破碎過程發(fā)熱置于冰上冷卻5s。

（3）磷酸酶抑制劑可加入如NaF、Na3VO4、β-甘油磷酸鈉或者直接購買商用的蛋白酶、磷酸酶抑制劑，以最大程度抑制磷酸酶活性，防止磷酸化蛋白去磷酸化。

（4）使用新鮮的轉(zhuǎn)膜液有助于提高轉(zhuǎn)膜效率和蛋白與膜的結(jié)合力。

（5）曝光時間要根據(jù)信號強度進行調(diào)整，可從短時間（如0.5~10s）開始嘗試，逐漸增加曝光時間，以獲得清晰且背景低的條帶圖像。

（6）磷酸化蛋白的條帶數(shù)參考抗體說明書。

如果你總是在做實驗時總會遇上這樣那樣的問題需要幫助時，請記得在WB實驗中遇到技術(shù)問題可添加技術(shù)微信：18570028002

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