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Question：免疫熒光操作指南有哪些？（普拉特澤生物提供長期穩(wěn)定的組織染色外包服務）

   答：免疫熒光實驗 Protocol

免疫熒光實驗的每一步都至關重要，任何一個環(huán)節(jié)出錯都可能導致實驗失敗。下面詳細介紹免疫熒光實驗的步驟，幫助大家掌握實驗要點。
（一）樣品準備：細胞狀態(tài)是關鍵 樣品準備是免疫熒光實驗的第一步，也是關鍵一步。細胞狀態(tài)直接影響實驗結果，無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，都需要正確處理。 1. 貼壁細胞：爬片操作要點  新手建議直接購買商品化的無菌爬片。放置爬片時，要注意爬片直徑要小于孔板，避免后續(xù)操作中出現(xiàn)麻煩。接種細胞后，小心取出爬片，倒扣在蓋玻片上，操作時要小心，避免細胞脫落。 2. 懸浮細胞：預處理讓細胞貼壁  爬片需提前幾小時用多聚賴氨酸或細胞黏附劑處理，以便懸浮細胞能夠貼壁。處理后接種細胞，后續(xù)步驟與貼壁細胞一致。這一步需要耐心，不能急于求成。 

 （二）固定：選對試劑，防止抗原位移 固定是為了讓細胞內(nèi)的抗原保持穩(wěn)定，不發(fā)生位移和降解。通常使用 4% 多聚甲醛室溫固定 15 分鐘，然后用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 分鐘。但如果是檢測磷酸化抗體，不能使用甲醛，而應選擇冰冷的無水甲醇或乙醇，否則磷酸蛋白會移位，導致實驗失敗。 

 （三）通透：讓抗體進入細胞內(nèi)部 通透的目的是讓抗體能夠順利進入細胞內(nèi)部與目標抗原結合。使用 0.5% Triton X-100 室溫通透 20 分鐘即可。但如果目標抗原在細胞膜上，這一步可以省略，以免破壞細胞結構。 

 （四）封閉：防止非特異性結合 封閉是為了防止一抗和二抗與細胞內(nèi)的非特異性位點結合，從而避免高背景噪音。通透后用 PBS 洗 3 次，吸干液體后，滴加 5% BSA（用 TBST 稀釋）或同來源血清，室溫封閉 1 小時。從這一步開始，要保持樣品濕潤，避免干燥導致背景信號過高。 

 （五）抗體孵育：濃度和時間是關鍵 抗體孵育是免疫熒光實驗的核心步驟，一抗和二抗的孵育條件直接影響實驗結果的準確性。 1. 一抗：4℃過夜更精準  按說明書稀釋一抗，吸盡封閉液后滴加，放入濕盒 4℃孵育過夜?；厥找豢购?，用 PBST 洗 3 次，每次 5 分鐘，搖床慢搖，去除非特異性結合的抗體。 2. 二抗：避光操作防淬滅  滴加稀釋好的熒光二抗，室溫孵育 1 小時，同樣用 PBST 洗 3 次。從加二抗開始，所有操作都要在暗處進行，避免熒光淬滅。 

 （六）復染核與封片：細節(jié)決定成像質量 最后一步是復染核與封片，雖然看似簡單，但也很重要。使用 DAPI 避光孵育 5 分鐘，用 PBST 洗去多余染料，然后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。封片時要小心避免氣泡，否則顯微鏡下會出現(xiàn)“馬賽克”，導致實驗失敗。 

 避坑 Tips：搞定串色，實驗結果更清晰 免疫熒光實驗里，串色問題特別煩人，一不小心就毀了實驗結果。下面這些小技巧，幫你輕松應對串色，讓實驗結果更干凈。
（一）細胞處理：密度和狀態(tài)很重要 

1. 鋪細胞別太密！

用狀態(tài)好、沒被污染的細胞做實驗，這是必須的。要是細胞被支原體污染了，那可就麻煩了，會出現(xiàn)各種奇怪的染色問題，核和抗體都會被染得亂七八糟，怎么洗都洗不掉。所以，實驗前一定要檢測支原體，別讓這些小東西毀了你的實驗。

（一）染色順序：核染放最后，濃度別太高

雙抗體染色的時候，別一開始就用Hoechst染核，這是個常見的錯誤。正確的做法是把核染放到最后封片的時候，而且要用低濃度的DAPI。核很容易著色，高濃度的染料會讓核的熒光太強，不僅會搶了其他信號的風頭，還可能導致熒光串色。記住，低調核染，信號才會更純凈。

（二）抗體選擇：種屬和濃度是關鍵

1. 一抗：種屬不同，避免“撞車”

雙抗體染色時，一抗的種屬選擇很重要。一定要用不同種屬的一抗，比如鼠和兔，這是經(jīng)典組合，效果很好。要是用雙鼠或雙兔的一抗，二抗很容易交叉結合，結果就是串色。另外，如果是外轉質粒，可以選擇標簽抗體，特異性高，濃度1:500左右就行；如果是內(nèi)源性蛋白，1:200就足夠了，別盲目追求高濃度，有時候過猶不及。

2. 二抗：室溫孵育，洗得更干凈

二抗孵育時，常溫1-2小時就行，記得全程避光。洗滌也很重要，二抗用TBST（可以多加些吐溫），能更好地洗掉非特異性結合的抗體；一抗用PBS就行。不同熒光標記的二抗，要選波長差異大的，比如綠光488、紅光555，這樣能減少光譜重疊，降低串色風險。

（三）拍攝技巧：波長和參數(shù)調對了嗎？

封片后的拍攝環(huán)節(jié)也不能馬虎。適當縮短激發(fā)光波長，能有效避免交叉波長干擾。用顯微鏡拍攝時，每個通道單獨設置濾光片，逐個掃描，別同時采集，這樣能大大減少串色。別偷懶不調參數(shù)，一張好圖勝過千言萬語，精心調整參數(shù)才能拍出滿意的照片。

常見問題：這些坑你踩過嗎？

（一）背景信號高？

免疫熒光實驗里，背景信號過高是讓人特別煩的問題。本來應該清晰的圖像，結果被一層亂七八糟的背景信號給蓋住了。這多半是因為實驗里一些小細節(jié)沒注意好。比如封閉沒做好，封閉液和二抗不是同來源的，這就相當于給細胞穿了件不合身的衣服，擋不住非特異性結合；還有洗滌不徹底，洗滌次數(shù)不夠，搖床速度太慢，多余的抗體和雜質就留在細胞上，背景信號肯定就上去了。所以說，實驗里的每一步都得認真，不能馬虎。

（二）信號弱或無信號？

要是實驗結果信號弱或者干脆沒信號，那可真是讓人著急。這時候得好好回想一下實驗過程。一抗是不是失效了？抗體是實驗的關鍵，要是它失活了，肯定沒法和抗原結合，也就沒信號了。再看看一抗?jié)舛仁遣皇翘?，孵育時間夠不夠？特別是4℃過夜孵育，溫度和時間都得達標，不然一抗和抗原結合不充分，信號自然就弱或者沒了。所以在實驗前，一定要仔細看抗體說明書，按要求操作，別憑感覺瞎搞。

（三）串色嚴重？

串色問題在免疫熒光實驗里特別麻煩，不同的熒光信號攪和在一起，實驗結果亂七八糟。要解決串色，就得回頭看看前面說的那些避坑 Tips。檢查一下細胞密度是不是合適，細胞太密容易增加非特異性染色和串色風險；看看抗體種屬是不是選對了，一抗種屬搭配不當，二抗就會交叉結合；熒光染料波長是不是合理，波長相近的染料容易光譜重疊；拍攝參數(shù)對不對，參數(shù)不對會讓串色更嚴重。免疫熒光實驗就像一場需要精準配合的舞蹈，從樣品準備到拍攝成像，每一步都得踩準點，不然就會串色。只要每一步都優(yōu)化好，實驗結果肯定能干凈漂亮。

免疫熒光實驗從樣品準備到拍攝成像，每一步都有挑戰(zhàn)，也都有技巧。記住了這些 Protocol 和避坑 Tips，就能避開串色的坑，讓實驗結果清晰又漂亮，以后發(fā)文章再也不用為圖發(fā)愁了！

不僅我吊，我的服務更吊

不是我吹，咱家除了產(chǎn)品能打，服務這塊兒更是拿捏得死死的！隨手翻了翻后臺好評，直接給我整得熱血沸騰

    在科研的征途中，與外包實驗公司的合作似乎已成為了一種趨勢，然而，如何選擇一家靠譜的外包公司，避免掉入“坑”中，卻是讓不少科研人員頭疼的問題。

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