上期的文獻分享，我們講了關于RNA甲基化一篇影響因子6分左右的SCI。今天，我們一起來看看影響因子12左右的文章怎么研究RNA甲基化的吧~
這次分享的文獻題目是：Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A，影響因子為11.492分，發(fā)表在2020年12月的RESEARCH ARTICLE 雜志上。
想了解高分文章是怎么研究RNA甲基化的伙伴們，現(xiàn)在就跟著我，踏著之前文獻解讀里整理的“標準步驟”往下看吧~
一、缺氧損害血管生成能力，巨細胞胚胎干細胞中ALKBH5表達上調(diào)
為了闡明m6A在缺血后血管生成中的作用，作者分離了心臟微血管內(nèi)皮細胞（CMECs）。CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)CMECs的存活能力在缺氧3小時后開始增加，在12小時時達到峰值，在24小時后又顯著下降（Figure 1A）。EdU實驗分析顯示，缺氧24小時后EdU陽性細胞的比例顯著降低（Figure1B-C）。此外，CMECs細胞的遷移、侵襲及血管形成能力在缺氧條件下亦顯著降低（Figure1B, D-F）。綜上，24小時缺氧抑制心臟微血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管生成能力。
m6A點斑實驗表明缺氧使得CMECs中m6A豐度顯著降低（Figure 1G）。而RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)甲基轉移酶WTAP和去甲基化酶ALKBH5在缺氧損傷后其mRNA水平顯著上調(diào)（Figure 1H），但在缺氧CMECs中，只有m6A去甲基化酶ALKBH5的蛋白水平表達顯著上調(diào)（Figure1I -J）。
二、ALKBH5過表達加劇了缺氧誘導的巨細胞的細胞功能障礙
接下來，作者通過一系列的實驗檢測缺氧誘導的ALKBH5是否影響CMECs血管生成。首先在常氧和低氧的CMECs模型中建立ALKBH5過表達模型（Figure 2A）。m6A斑點實驗顯示，在缺氧和常氧條件下，ALKBH5過表達后m6A豐度降低（Figure 2B）。此外，ALKBH5的過表達降低了缺氧條件下的CMECs增殖（Figure 2C-E）、遷移和侵襲（Figure 2F-I）及血管生成能力（Figure2J-K），但是對常氧條件下的細胞無影響。綜上，ALKBH5的上調(diào)嚴重加劇了缺氧條件下的CMECs功能障礙，從而導致血管生成受損。
三、ALKBH5敲低降低了CMECs缺氧誘導的功能障礙
首先，在常氧和缺氧條件下，建立ALKBH5敲低模型（Figure 3A）。m6A斑點實驗發(fā)現(xiàn)，常氧和缺氧條件下，ALKBH5的敲低顯著均提升了整體m6A水平（Figures 3B）。但是，僅在缺氧條件下增強了細胞的增殖（Figures 3C-E）、遷移和侵襲（Figures 3F-I）以及血管形成能力（Figures 3J-K）。在常氧條件下，ALKBH5的敲低不影響上述細胞功能。綜上，ALKBH5的敲低在防止缺氧誘導的內(nèi)皮血管生成損傷方面起著關鍵作用。
四、MeRIP-seq與RNA-seq聯(lián)合發(fā)現(xiàn)了ALKBH5潛在的靶基因
以上結果已經(jīng)表明，ALKBH5與缺氧誘導的內(nèi)皮血管生成密切相關，對ALKBH5敲降后，通過MeRIP-seq與RNA-seq方法進行檢測，MeRIPseq共發(fā)現(xiàn)12783個共有峰，對照組477個獨特峰，ALKBH5敲降CMECs中2358個獨特峰。此外，發(fā)現(xiàn)了771個低甲基化峰和1072個高甲基化峰（Figure 4A），MeRIP-seq進一步揭示了峰的分布特征（Figure 4B）和差異甲基化mRNA峰值的百分比（Figure 4C）?；谶@些數(shù)據(jù)，對兩個CMECs組進行了具有代表性的motif分析(Figure 4D)。富集基因差異表達分析顯示，1352個基因表達下調(diào)，2914個基因表達上調(diào)(Figure 4E)，C型利鈉肽和FBXW5分別為低甲基化和高甲基化的代表(Figure 4F)。對這些基因進行了GO分析，發(fā)現(xiàn)低甲基化轉錄本的富集主要參與細胞周期和RNA代謝等過程，而高甲基化轉錄本主要富集于血管新生和細胞增殖調(diào)控(Figure 4G)。POSTAR、血管生成數(shù)據(jù)庫、MeRIP-seq 數(shù)據(jù)和RNA-seq 數(shù)據(jù)得到，ALKBH5的靶基因能調(diào)節(jié)血管生成。從中選出的SKP2、WNT5A、FGF18可能是ALKBH5促血管生成的靶基因（Figure 4H），故后續(xù)對它們進行進一步研究。
五、ALKBH5調(diào)控WNT5A mRNA的穩(wěn)定性和衰減情況
MeRIP-seq數(shù)據(jù)顯示，敲除ALKBH5后，SKP2、WNT5A和FGF18的m6A豐度顯著增加（Figure 5A-B），RT-qPCR和Western blot分析得到，沉默ALKBH5，WB和QPCR的實驗表明，WNT5A表達增高，但SKP2和FGF18表達變化不明顯（Figure 5C-D），故后續(xù)選擇WNT5A來進行研究。因為mRNA m6A的內(nèi)部修飾對靶基因存在mRNA的穩(wěn)定性和衰減存在影響，所以采用放線菌素D來檢測WNT5A mRNA的穩(wěn)定性和衰減情況，添加放線菌素D之后，WNT5A表達呈時間依賴性降低，敲除 ALKBH5能顯著延遲WNT5A mRNA的降解，從而延長了其半衰期（Figure 5E）。進一步發(fā)現(xiàn)，ALKBH5過表達顯著降低了WNT5A的蛋白和mRNA表達水平、縮短了WNT5A mRNA的半衰期并降低了其穩(wěn)定性（Figure 5F-H）。而且，通過一系列細胞生物學實驗發(fā)現(xiàn)，WNT5A激動劑可以顯著逆轉過表達ALKBH5對CMECs增殖、遷移、血管形成的抑制作用（Figure 5I-L）。
以上結果得到，ALKBH5通過去除轉錄后的m6A修飾，促進WNT5A mRNA的衰變，降低其半衰期，從而影響缺氧條件下CMECs的生物學功能。
六、ALKBH5過表達減弱小鼠后肢缺血造成的小鼠缺血損傷后的血流恢復和血管生成作用
作者建立了小鼠后肢缺血模型，然后檢測ALKBH5在模型中一段時間的表達情況。結果所示，ALKBH5隨著時間的推移呈動態(tài)變化，在6小時以內(nèi)，呈增高趨勢，缺血后1-21天時，呈降低趨勢，到28天時，ALKBH5的表達已回復至缺血前。為了研究ALKBH5在體內(nèi)對缺血血管生成的影響，在小鼠后肢缺血前4周，通過AAV注射小鼠腓腸肌，使ALKBH5持續(xù)過表達（Figure 6A）。數(shù)據(jù)顯示，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白顯著上調(diào)（補充數(shù)據(jù)加Figure 6B），在過表達ALKBH5的情況下，m6A豐度顯著降低（Figure 6C），通過激光多普勒超聲掃描系統(tǒng)后肢缺血后的血流恢復情況發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達ALKBH5
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