如何巧妙設(shè)計(jì)引物？
2023-11-14 17:29:47
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起學(xué)習(xí)新的實(shí)驗(yàn)——設(shè)計(jì)引物，引物是一種人工合成的DNA片段，用于擴(kuò)增特定的DNA序列。在PCR實(shí)驗(yàn)中，引物與模板DNA結(jié)合，延伸合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈，從而實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。因此，引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于與模板DNA的特異性結(jié)合。
引物設(shè)計(jì)介紹由普拉特澤生物表達(dá)檢測品臺(tái)總結(jié)分享，表達(dá)檢測平臺(tái)為廣大科研實(shí)驗(yàn)人員提供設(shè)計(jì)引物服務(wù)，先一起來學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)如何巧妙設(shè)計(jì)引物。
一、了解引物的定義
引物又稱為寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一對(duì)，引物1和引物2。由于DNA聚合酶只能從核苷酸鏈的5'端到3'端進(jìn)行復(fù)制，也就是只能識(shí)別3'的尾端，而且只能把核苷酸連到已經(jīng)和DNA模板互補(bǔ)產(chǎn)生的多核苷酸鏈上，所以引物1和2分別于雙鏈DNA的兩條鏈的尾部（就是末尾是3'端的那一邊）結(jié)合，為那些脫氧核苷酸提供3'的末端，就相當(dāng)于開了個(gè)頭。然后在DNA聚合酶的作用下合成兩條新鏈。而那段引物就成了新鏈的一部分。 其實(shí)在生物體內(nèi)的DNA復(fù)制也是這樣的一個(gè)過程，只是引物是人體自身合成的
二、選擇合適的引物設(shè)計(jì)軟件
引物設(shè)計(jì)需要借助專業(yè)的軟件工具來實(shí)現(xiàn)。目前市面上有多種引物設(shè)計(jì)軟件，如Primer Premier、Genedoc等。這些軟件可以幫助我們快速篩選出特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高的引物
引物的驗(yàn)證很多時(shí)候，我們可能從文章中、實(shí)驗(yàn)室遺留的資料中，翻找出了某對(duì)引物，但是這個(gè)時(shí)候往往我們心里是可能沒底的。
這個(gè)時(shí)候運(yùn)用簡單的方法進(jìn)行引物驗(yàn)證，是一個(gè)比較推薦的方式。1、網(wǎng)址引物設(shè)計(jì)和驗(yàn)證的推薦網(wǎng)站為：Primer-Blast。
這是一個(gè)專門設(shè)計(jì)用于在已知序列上設(shè)計(jì)引物或探針的工具。使用BLAST-Primer，可以輸入一個(gè)序列或一組序列，并為這些序列設(shè)計(jì)引物或探針，以便用于PCR擴(kuò)增或雜交檢測等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
需要注意的是，NCBI還有一個(gè)網(wǎng)站叫：BLAST。注意二者不要弄混。BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)，用于在大型生物數(shù)據(jù)庫中查找序列相似性。BLAST的主要應(yīng)用包括：找到給定DNA或蛋白質(zhì)序列在已知數(shù)據(jù)庫中的同源物，識(shí)別同源蛋白質(zhì)的功能，以及進(jìn)行物種分類。BLAST可用于多種生物學(xué)領(lǐng)域，包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物研發(fā)等。
三、避免引物自環(huán)和二聚體形成
引物自環(huán)是指引物自身互補(bǔ)序列的結(jié)合，這會(huì)導(dǎo)致PCR效率降低。為了避免自環(huán)，可以通過軟件檢查引物的互補(bǔ)序列，并調(diào)整引物序列以避免自環(huán)。另外，二聚體形成也會(huì)影響PCR的效率和特異性。因此，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)該選擇避免容易形成二聚體的序列。
四、檢查引物的互補(bǔ)序列
在選擇引物序列之后，應(yīng)該使用在線工具檢查引物的互補(bǔ)序列，以確保它們不會(huì)與非目標(biāo)DNA序列結(jié)合。這可以幫助減少非特異性擴(kuò)增和假陽性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。
五、驗(yàn)證引物的特異性
最后，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證引物的特異性。使用選擇的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。如果PCR產(chǎn)物的大小與預(yù)期一致，且沒有其他雜帶出現(xiàn)，那么可以認(rèn)為該引物是特異的。如果PCR產(chǎn)物大小不一致或出現(xiàn)其他雜帶，那么需要重新設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行驗(yàn)證。
總之，巧妙地設(shè)計(jì)引物是基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。為了確保PCR的效率和特異性，需要選擇合適的引物序列，確定引物的長度和GC含量，避免自環(huán)和二聚體形成，檢查引物的互補(bǔ)序列，并驗(yàn)證引物的特異性。通過遵循這些步驟，就可以設(shè)計(jì)出適合實(shí)驗(yàn)的引物，并獲得更準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果。
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