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——檢測(cè)293T細(xì)胞中Myc的表達(dá)
前兩篇我們總結(jié)了Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果中WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟（上）今天來(lái)學(xué)習(xí)WB實(shí)驗(yàn)操作下篇，希望大家學(xué)習(xí)參考，能夠順利進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，普拉特澤表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)長(zhǎng)期為大家提供WB實(shí)驗(yàn)代做外包服務(wù)。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

利用Western Blot技術(shù)檢驗(yàn)不同的處理之后，293T細(xì)胞中Myc蛋白的表達(dá)量變化。

二、實(shí)驗(yàn)樣本及分組

2.1 實(shí)驗(yàn)樣本

2.2 實(shí)驗(yàn)分組
細(xì)胞：293T細(xì)胞

分組：Control、pCMV-Myc、EGFR-TK-pCMV-Myc、EGFR-TK(S720A)-pCMV-Myc

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 抗體工作信息

3.2 WB檢測(cè)293T細(xì)胞中Myc的蛋白水平

圖1 Myc的WB表達(dá)水平檢測(cè)圖

圖2Myc的WB檢測(cè)灰度數(shù)據(jù)柱形圖

四、實(shí)驗(yàn)材料

5.1主要儀器

5.2主要試劑

五、實(shí)驗(yàn)原理

蛋白免疫印跡( Western Blot) 采用的是聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的特異性抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。

六、實(shí)驗(yàn)步驟

7.1.蛋白提取

(1)樣本的收集：

細(xì)胞：用1 ml生理鹽水對(duì)離心下來(lái)的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，同時(shí)將其轉(zhuǎn)移至1.5 ml的離心管中。

組織：取適量組織剪碎，研磨勻漿。

(2)按1 ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）

(3)根據(jù)細(xì)胞量的多少，每管細(xì)胞加100-500 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。

(4)4℃下12000 rpm離心10 min。離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移至1.5 ml的離心管中，用于蛋白定量檢測(cè)。若不能及時(shí)定量蛋白濃度，請(qǐng)置于－80℃保存。

7.2.蛋白定量及處理（BCA法）

(1)使用時(shí)將BCA試劑盒中 Solution A搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積Solution A加1體積Solution B(50:1)配置適量BCA工作液，充分混勻后即成淡綠色的工作液。BCA工作液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)品（1mg/ml BSA）按0、1、2、4、6、8、10 μl的量分別加入96孔板中，再加入去離子水將所有標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)足到10 μl。

(3)加1 μl的樣品到96孔板中，加去離子水補(bǔ)足到10 μl。

(4)各孔加入200 μl BCA工作液，輕輕用移液器吹打混勻（注意不要產(chǎn)生氣泡以免影響讀數(shù)），37℃孵育30 min。

(5)冷卻到室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A562的吸光度值。

(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

(7)蛋白變性處理：蛋白溶液與5×loading buffer 按照體積比4：1混勻（此時(shí)蛋白濃度變成實(shí)際檢測(cè)濃度的0.8倍），置于沸水中煮10min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，或儲(chǔ)存于-80℃，避免反復(fù)凍融。

(8)蛋白濃度的計(jì)算公式

舉例標(biāo)曲為：Y=aX+b(Y為OD值，X為測(cè)定濃度）

樣品蛋白濃度=[（Y-b）/a]×稀釋倍數(shù)

7.3.Western Blot

(1)配制分離膠和濃縮膠：根據(jù)目的蛋白分子量大小，配分離膠和5%濃縮膠；

蛋白分子量（kDa）分離膠濃度%

：計(jì)算含20~80 μg蛋白的溶液體積，即為上樣量。用1×loading buffer 補(bǔ)至每個(gè)加樣孔的總體積一致；

(3)電泳：濃縮膠電壓為80 V，40 min，分離膠電壓120 V，30-50 min。溴酚藍(lán)跑至膠底即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；

(4)轉(zhuǎn)膜：恒壓100V，0.45/0.22 μm PVDF膜；

(5)封閉： 將PVDF膜完全浸沒(méi)在5% milk-PBST或5% BSA-PBST中，室溫輕搖60 min或4℃過(guò)夜；

(6)一抗孵育：用5% BSA-PBST稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜；

(7)洗膜：次日取出PVDF膜，PBST洗膜5次，每次6 min；

(8)二抗孵育：PBST稀釋二抗，室溫孵育60 min；

(9)洗膜：PBST洗膜5次，每次6 min；

(10)顯影：ECL A和B液按體積1:1混合后均勻滴加在膜上，按需求設(shè)置曝光時(shí)間及曝光類(lèi)型，開(kāi)始曝光，曝光結(jié)束后保存圖片并導(dǎo)出圖片。

7.4.圖像分析

用圖像分析軟件Image J對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

好啦，WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟（下）咱們就介紹完啦，如果您也對(duì)WB實(shí)驗(yàn)感興趣或正在準(zhǔn)備WB實(shí)驗(yàn)的話(huà)歡迎隨時(shí)咨詢(xún)普拉特澤生物~