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  普拉特澤生物為廣大生命科學(xué)研究人員提供QPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)實(shí)方案的要求選擇不同的檢測(cè)方法，本文就跟大家一起繼續(xù)闡述QPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)的步驟與報(bào)告。
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

通過(guò)QPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)定量檢測(cè)基因表達(dá)量。

二、實(shí)驗(yàn)樣品及分組

1. 實(shí)驗(yàn)樣本

備注：包括干預(yù)細(xì)胞用的相關(guān)試劑均按實(shí)驗(yàn)樣品登記，每行登記一個(gè)或一組獨(dú)立樣品。

2 .實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞： SH-SY5Y

分組：

常規(guī)培養(yǎng)條件：完全培養(yǎng)基，95%空氣+5%二氧化碳；

OGD培養(yǎng)條件：無(wú)糖Earle液，95%氮?dú)?5%二氧化碳處理4h，復(fù)氧復(fù)糖24h

指標(biāo)：1、核質(zhì)分離后檢測(cè)lncRNA BDNF-AS（NR_002832.2）

2、提取總RNA檢測(cè)BDNF（Gene ID: 627）、APP（ Gene ID: 351）、BACE1（ Gene ID: 23621）、BDNF-AS的表達(dá)（默認(rèn)最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本）

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

四、實(shí)驗(yàn)材料

1.主要實(shí)驗(yàn)儀器

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材

五、實(shí)驗(yàn)原理

QPCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。根據(jù)熒光信號(hào)的變化能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的分析就能對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

六、實(shí)驗(yàn)步驟

1.引物設(shè)計(jì)

2.樣品前期處理

向細(xì)胞樣本中加入500 μl Trizol。
3. RNA提取

(1)     向加有Trizol的1.5 ml EP管中加入100 μl氯仿，震蕩混勻后，靜置5 min，在12000 rpm，4度離心10 min。

(2)     從離心機(jī)中取出1.5 ml EP管，再將上層無(wú)色透明的水相層吸入到另一干凈的1.5 mlEP管中。（樣品會(huì)分為三層：下層有機(jī)相層，中間層和上層的水相層，RNA位于上層水相中。）加入等體積的異丙醇，上下輕輕顛倒混勻之后，靜置10 min，再12000 rpm，4度離心10 min。

(3)     離心之后可在EP管壁或管底看到膠狀沉淀出現(xiàn)，沉淀就是要提取的RNA。小心棄去上清，不要將沉淀倒掉了。

(4)     用1 ml 75℅乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行洗滌。然后于4℃ 7000 rpm離心5分鐘，將上清盡量去除干凈。

(5)      室溫靜置干燥，大約干燥5～10分鐘即可。（不要真空離心干燥，過(guò)于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低）。所有EP管中加入25 μl 的DEPC H₂O，用槍頭吹打幾次，使RNA充分溶解，-80℃保存。

(6)     RNA濃度檢測(cè)：使用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度。

4.RNA濃度及純度測(cè)定

（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分）

5.逆轉(zhuǎn)錄PCR

1. 按以下組份分別配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

  2.cDNA立刻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或者置于4℃保存。

六、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

1. 反應(yīng)體系的配置

2.反應(yīng)條件設(shè)置：

     擴(kuò)增程序：

3.熔解程序

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