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  本期普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是對(duì)水稻花樣本進(jìn)行TUNEL染色，TUNEL染色是一種常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。它基于凋亡過(guò)程中DNA雙鏈斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將標(biāo)記的dUTP連接到DNA斷裂處，從而檢測(cè)凋亡細(xì)胞。而普拉特澤生物——病理檢測(cè)平臺(tái)也非常重視這一點(diǎn)，為廣大科研人員提供酵TUNEL染色實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，同時(shí)也詳細(xì)說(shuō)明了TUNEL染色步驟分享給大家一起共勉！

一、        實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

對(duì)水稻花樣本進(jìn)行TUNEL染色。

二、        實(shí)驗(yàn)樣本及分組

39個(gè)水稻花石蠟樣本

  三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tunel

 PI

圖1 TUNEL染色示意圖（400×）

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

組織中有細(xì)胞凋亡，全細(xì)胞背景為紅色熒光，凋亡部位為綠色熒光（Merge后呈黃色）

五、 實(shí)驗(yàn)材料

1.主要儀器

2.主要試劑

一、        實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)180~200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光標(biāo)記，產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，從而可以通過(guò)顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。本次實(shí)驗(yàn)所用到的試劑盒中凋亡樣本會(huì)被標(biāo)記為綠色，與碘化丙啶標(biāo)記的紅色全細(xì)胞背景重疊后呈黃色。

二、        方法步驟

1、  石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無(wú)水乙醇Ⅰ10min-無(wú)水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

2、  修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，室溫孵育15min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

3、  破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育10min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

4、  末端標(biāo)記反應(yīng)：取反應(yīng)液加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃水浴鍋孵育60min，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

5、  終止反應(yīng)：玻片放入2×SSC室溫浸泡15min終止反應(yīng)。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

6、  背景染色：將片子置于1ug/ml的碘化丙啶中，在黑暗條件下染背景。玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上避光晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

7、  封片：切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

8、  鏡檢拍照：切片于激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

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