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巨噬細(xì)胞分離與純化步驟【巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包】

巨噬細(xì)胞分離與純化實(shí)驗(yàn)步驟由普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)。巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的白血球，源自單核細(xì)胞，是生物體免疫系統(tǒng)中非常重要的一部分。巨噬細(xì)胞一直是生物醫(yī)學(xué)科研人員的研究重點(diǎn)，普拉特澤生物流式檢測(cè)平臺(tái)為廣大科研人員提供巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，本文咱們先來(lái)看看巨噬細(xì)胞的分離與純化步驟吧：

一、細(xì)胞分離

1、取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）無(wú)菌的液體石蠟或巰基乙酸肉湯或4%淀粉肉湯。3～4天以后收集腹腔細(xì)胞。

2、如要收集腹腔靜置巨噬細(xì)胞，不注射刺激物，直接從一步開(kāi)始。放血處死動(dòng)物，以減少腹腔中的紅細(xì)胞。消毒腹部，沿腹中線注入3～4mL（豚鼠20～40ml，家兔50～70mL）冰中預(yù)冷的無(wú)菌PBS-H（含10U/mL肝素和10%小牛血清的PBS）。輕輕按摩腹部5分鐘。

3、以下均無(wú)菌操作。剪開(kāi)腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣容量的預(yù)冷PBS-H沖洗腹腔2～3次。合并滲出液于離心管中，4℃離心250×g 10分鐘，去上清液。

4、用預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，每次4℃離心250×g 10分鐘，去上清液。用預(yù)冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞并決定細(xì)胞活力。

二、巨噬細(xì)胞的分離和純化

1、取2～3公斤重的家兔，耳緣靜脈注射10 mL空氣處死動(dòng)物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉動(dòng)物。仰臥固定，消毒胸部，剪開(kāi)胸壁。以下過(guò)程注意無(wú)菌操作。小心從環(huán)狀軟骨下方剪下氣管，分離心臟和血管，取出肺，剪去脂肪和結(jié)締組織。用無(wú)菌紗布小心擦凈肺表面，稱重。

2、分離肺泡巨噬細(xì)胞：用夾子夾住氣管，使肺懸空。向氣管中注射40ml無(wú)菌的冷生理鹽水，讓生理鹽水進(jìn)入全部肺泡。用鑷子提起氣管，從夾子下面剪斷氣管，將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法，用40 mL無(wú)菌冷生理鹽水沖洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3、分離肺組織中的巨噬細(xì)胞：取出肺泡巨噬細(xì)胞后，剪去氣管，將肺組織放在有冷RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。平皿置冰上，用吸滿冷RPMI-1640培養(yǎng)液的20 mL注射器接23號(hào)針頭，一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織，直到肺組織與支氣管樹(shù)全部分離。使肺組織通過(guò)00目的鋼絲網(wǎng)，分離單細(xì)胞。

4、以下過(guò)程均在4℃中進(jìn)行。分別處移動(dòng)圖片理肺泡巨噬細(xì)胞和肺組織中的巨噬細(xì)胞：離心200×g10分鐘，去上清液。輕彈試管，懸浮細(xì)胞，加入10 mL低滲液（20mmol/LTris，0.75%氯化銨，pH7.4），37℃處理3～5分鐘，溶解紅細(xì)胞。紅細(xì)胞通常分別占肺泡巨噬細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞的1%和10%。也可以不用低滲處理，直接在淋巴細(xì)胞分離液上分離巨噬細(xì)胞。

5、離心200×g10分鐘，去上清液。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次。將細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液（比重1.077）上，離心400×g20分鐘，收集交界面的巨噬細(xì)胞。棄去沉淀的死細(xì)胞和紅細(xì)胞。

6、用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌巨噬細(xì)胞2次。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞配成所需濃度。此時(shí)巨噬細(xì)胞活力可達(dá)90%以上，巨噬細(xì)胞占全部細(xì)胞的90%以上。

好啦，巨噬細(xì)胞的分離純化實(shí)驗(yàn)咱們就講解到這里啦，如果您還有什么其他的問(wèn)題或有巨噬細(xì)胞外包的需求歡迎直接留言，普拉特澤生物隨時(shí)為您服務(wù)~

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