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Question：免疫熒光操作指南有哪些？（普拉特澤生物提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的組織染色外包服務(wù)）

   答：免疫熒光實(shí)驗(yàn) Protocol

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的每一步都至關(guān)重要，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出錯(cuò)都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。下面詳細(xì)介紹免疫熒光實(shí)驗(yàn)的步驟，幫助大家掌握實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)。
（一）樣品準(zhǔn)備：細(xì)胞狀態(tài)是關(guān)鍵 樣品準(zhǔn)備是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，也是關(guān)鍵一步。細(xì)胞狀態(tài)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，都需要正確處理。 1. 貼壁細(xì)胞：爬片操作要點(diǎn)  新手建議直接購(gòu)買商品化的無菌爬片。放置爬片時(shí)，要注意爬片直徑要小于孔板，避免后續(xù)操作中出現(xiàn)麻煩。接種細(xì)胞后，小心取出爬片，倒扣在蓋玻片上，操作時(shí)要小心，避免細(xì)胞脫落。 2. 懸浮細(xì)胞：預(yù)處理讓細(xì)胞貼壁  爬片需提前幾小時(shí)用多聚賴氨酸或細(xì)胞黏附劑處理，以便懸浮細(xì)胞能夠貼壁。處理后接種細(xì)胞，后續(xù)步驟與貼壁細(xì)胞一致。這一步需要耐心，不能急于求成。 

 （二）固定：選對(duì)試劑，防止抗原位移 固定是為了讓細(xì)胞內(nèi)的抗原保持穩(wěn)定，不發(fā)生位移和降解。通常使用 4% 多聚甲醛室溫固定 15 分鐘，然后用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 分鐘。但如果是檢測(cè)磷酸化抗體，不能使用甲醛，而應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或乙醇，否則磷酸蛋白會(huì)移位，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。 

 （三）通透：讓抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部 通透的目的是讓抗體能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與目標(biāo)抗原結(jié)合。使用 0.5% Triton X-100 室溫通透 20 分鐘即可。但如果目標(biāo)抗原在細(xì)胞膜上，這一步可以省略，以免破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 

 （四）封閉：防止非特異性結(jié)合 封閉是為了防止一抗和二抗與細(xì)胞內(nèi)的非特異性位點(diǎn)結(jié)合，從而避免高背景噪音。通透后用 PBS 洗 3 次，吸干液體后，滴加 5% BSA（用 TBST 稀釋）或同來源血清，室溫封閉 1 小時(shí)。從這一步開始，要保持樣品濕潤(rùn)，避免干燥導(dǎo)致背景信號(hào)過高。 

 （五）抗體孵育：濃度和時(shí)間是關(guān)鍵 抗體孵育是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的核心步驟，一抗和二抗的孵育條件直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 1. 一抗：4℃過夜更精準(zhǔn)  按說明書稀釋一抗，吸盡封閉液后滴加，放入濕盒 4℃孵育過夜?；厥找豢购螅?PBST 洗 3 次，每次 5 分鐘，搖床慢搖，去除非特異性結(jié)合的抗體。 2. 二抗：避光操作防淬滅  滴加稀釋好的熒光二抗，室溫孵育 1 小時(shí)，同樣用 PBST 洗 3 次。從加二抗開始，所有操作都要在暗處進(jìn)行，避免熒光淬滅。 

 （六）復(fù)染核與封片：細(xì)節(jié)決定成像質(zhì)量 最后一步是復(fù)染核與封片，雖然看似簡(jiǎn)單，但也很重要。使用 DAPI 避光孵育 5 分鐘，用 PBST 洗去多余染料，然后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。封片時(shí)要小心避免氣泡，否則顯微鏡下會(huì)出現(xiàn)“馬賽克”，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。 

 避坑 Tips：搞定串色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更清晰 免疫熒光實(shí)驗(yàn)里，串色問題特別煩人，一不小心就毀了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下面這些小技巧，幫你輕松應(yīng)對(duì)串色，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果更干凈。
（一）細(xì)胞處理：密度和狀態(tài)很重要 

1. 鋪細(xì)胞別太密！

用狀態(tài)好、沒被污染的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，這是必須的。要是細(xì)胞被支原體污染了，那可就麻煩了，會(huì)出現(xiàn)各種奇怪的染色問題，核和抗體都會(huì)被染得亂七八糟，怎么洗都洗不掉。所以，實(shí)驗(yàn)前一定要檢測(cè)支原體，別讓這些小東西毀了你的實(shí)驗(yàn)。

（一）染色順序：核染放最后，濃度別太高

雙抗體染色的時(shí)候，別一開始就用Hoechst染核，這是個(gè)常見的錯(cuò)誤。正確的做法是把核染放到最后封片的時(shí)候，而且要用低濃度的DAPI。核很容易著色，高濃度的染料會(huì)讓核的熒光太強(qiáng)，不僅會(huì)搶了其他信號(hào)的風(fēng)頭，還可能導(dǎo)致熒光串色。記住，低調(diào)核染，信號(hào)才會(huì)更純凈。

（二）抗體選擇：種屬和濃度是關(guān)鍵

1. 一抗：種屬不同，避免“撞車”

雙抗體染色時(shí)，一抗的種屬選擇很重要。一定要用不同種屬的一抗，比如鼠和兔，這是經(jīng)典組合，效果很好。要是用雙鼠或雙兔的一抗，二抗很容易交叉結(jié)合，結(jié)果就是串色。另外，如果是外轉(zhuǎn)質(zhì)粒，可以選擇標(biāo)簽抗體，特異性高，濃度1:500左右就行；如果是內(nèi)源性蛋白，1:200就足夠了，別盲目追求高濃度，有時(shí)候過猶不及。

2. 二抗：室溫孵育，洗得更干凈

二抗孵育時(shí)，常溫1-2小時(shí)就行，記得全程避光。洗滌也很重要，二抗用TBST（可以多加些吐溫），能更好地洗掉非特異性結(jié)合的抗體；一抗用PBS就行。不同熒光標(biāo)記的二抗，要選波長(zhǎng)差異大的，比如綠光488、紅光555，這樣能減少光譜重疊，降低串色風(fēng)險(xiǎn)。

（三）拍攝技巧：波長(zhǎng)和參數(shù)調(diào)對(duì)了嗎？

封片后的拍攝環(huán)節(jié)也不能馬虎。適當(dāng)縮短激發(fā)光波長(zhǎng)，能有效避免交叉波長(zhǎng)干擾。用顯微鏡拍攝時(shí)，每個(gè)通道單獨(dú)設(shè)置濾光片，逐個(gè)掃描，別同時(shí)采集，這樣能大大減少串色。別偷懶不調(diào)參數(shù)，一張好圖勝過千言萬語(yǔ)，精心調(diào)整參數(shù)才能拍出滿意的照片。

常見問題：這些坑你踩過嗎？

（一）背景信號(hào)高？

免疫熒光實(shí)驗(yàn)里，背景信號(hào)過高是讓人特別煩的問題。本來應(yīng)該清晰的圖像，結(jié)果被一層亂七八糟的背景信號(hào)給蓋住了。這多半是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)里一些小細(xì)節(jié)沒注意好。比如封閉沒做好，封閉液和二抗不是同來源的，這就相當(dāng)于給細(xì)胞穿了件不合身的衣服，擋不住非特異性結(jié)合；還有洗滌不徹底，洗滌次數(shù)不夠，搖床速度太慢，多余的抗體和雜質(zhì)就留在細(xì)胞上，背景信號(hào)肯定就上去了。所以說，實(shí)驗(yàn)里的每一步都得認(rèn)真，不能馬虎。

（二）信號(hào)弱或無信號(hào)？

要是實(shí)驗(yàn)結(jié)果信號(hào)弱或者干脆沒信號(hào)，那可真是讓人著急。這時(shí)候得好好回想一下實(shí)驗(yàn)過程。一抗是不是失效了？抗體是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，要是它失活了，肯定沒法和抗原結(jié)合，也就沒信號(hào)了。再看看一抗?jié)舛仁遣皇翘?，孵育時(shí)間夠不夠？特別是4℃過夜孵育，溫度和時(shí)間都得達(dá)標(biāo)，不然一抗和抗原結(jié)合不充分，信號(hào)自然就弱或者沒了。所以在實(shí)驗(yàn)前，一定要仔細(xì)看抗體說明書，按要求操作，別憑感覺瞎搞。

（三）串色嚴(yán)重？

串色問題在免疫熒光實(shí)驗(yàn)里特別麻煩，不同的熒光信號(hào)攪和在一起，實(shí)驗(yàn)結(jié)果亂七八糟。要解決串色，就得回頭看看前面說的那些避坑 Tips。檢查一下細(xì)胞密度是不是合適，細(xì)胞太密容易增加非特異性染色和串色風(fēng)險(xiǎn)；看看抗體種屬是不是選對(duì)了，一抗種屬搭配不當(dāng)，二抗就會(huì)交叉結(jié)合；熒光染料波長(zhǎng)是不是合理，波長(zhǎng)相近的染料容易光譜重疊；拍攝參數(shù)對(duì)不對(duì)，參數(shù)不對(duì)會(huì)讓串色更嚴(yán)重。免疫熒光實(shí)驗(yàn)就像一場(chǎng)需要精準(zhǔn)配合的舞蹈，從樣品準(zhǔn)備到拍攝成像，每一步都得踩準(zhǔn)點(diǎn)，不然就會(huì)串色。只要每一步都優(yōu)化好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果肯定能干凈漂亮。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)從樣品準(zhǔn)備到拍攝成像，每一步都有挑戰(zhàn)，也都有技巧。記住了這些 Protocol 和避坑 Tips，就能避開串色的坑，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰又漂亮，以后發(fā)文章再也不用為圖發(fā)愁了！

不僅我吊，我的服務(wù)更吊

不是我吹，咱家除了產(chǎn)品能打，服務(wù)這塊兒更是拿捏得死死的！隨手翻了翻后臺(tái)好評(píng)，直接給我整得熱血沸騰

    在科研的征途中，與外包實(shí)驗(yàn)公司的合作似乎已成為了一種趨勢(shì)，然而，如何選擇一家靠譜的外包公司，避免掉入“坑”中，卻是讓不少科研人員頭疼的問題。

為了幫助科研小伙伴們?cè)谶@條路上少走彎路，小普特意整理了一份對(duì)接外包公司的“避雷”寶典——同時(shí)，也將為大家揭秘一家值得信賴的優(yōu)質(zhì)外包伙伴——普拉特澤生物科研服務(wù)有限公司

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科研實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，自己動(dòng)手費(fèi)時(shí)費(fèi)力。選擇外包，你就能把這些寶貴的時(shí)間投入到其他更重要的科研任務(wù)中。

2. ?經(jīng)費(fèi)精明使用?：
實(shí)驗(yàn)儀器昂貴且種類繁多，全部購(gòu)置將是一筆不小的開銷。而外包則能讓你將有限的科研經(jīng)費(fèi)用在刀刃上，避免不必要的浪費(fèi)。 ?

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面對(duì)操作復(fù)雜或跨專業(yè)的實(shí)驗(yàn)器械，自己摸索不僅耗時(shí)耗力，還可能浪費(fèi)大量實(shí)驗(yàn)耗材。而外包則能讓你免去這些煩惱，直接享受專業(yè)團(tuán)隊(duì)帶來的高效服務(wù)。

4. ?結(jié)果更靠譜?：
自己動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)，結(jié)果往往充滿不確定性。而交給專業(yè)的外包機(jī)構(gòu)，則能大大提高獲得靠譜結(jié)果的概率，為你的科研推進(jìn)和論文發(fā)表提供有力支持。

5. ?論文發(fā)表加速器?：
數(shù)據(jù)收集是論文發(fā)表的關(guān)鍵一環(huán)，但自己動(dòng)手往往進(jìn)度緩慢。而外包則能讓你在短時(shí)間內(nèi)獲得所需的素材，從而加速科研成果的產(chǎn)出和論文的發(fā)表。

6. ?實(shí)時(shí)掌控進(jìn)度?：
雖然實(shí)驗(yàn)外包出去了，但你依然可以隨時(shí)了解實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，確保數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可靠性。 ?

7.政策導(dǎo)向支持?：
實(shí)驗(yàn)外包符合政策方向，無需擔(dān)心學(xué)術(shù)道德問題。作為科研人，可以放心選擇這一合作方式。

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