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        熒光定量PCR實驗常見問題及其解決方法由普拉特澤生物為大家總結分享，普拉特澤生物表達檢測平臺專業(yè)承接熒光定量PCR實驗代做服務，在實時熒光定量PCR的實驗操作中積累了大量的經(jīng)驗，同時也遇到了不計其數(shù)的問題，表達檢測實驗的技術在一次又一次實踐中總結了遇到各種常見問題的原因和解決方法。本文就跟大家一起來看實驗過程中出現(xiàn)頻率最高的一些問題：

        1、RNA得率低

        原因1：樣品裂解不完全

        解決：適當選擇起始材料的量，加入合適體積的裂解液。

        原因2：勻漿不充分

        解決：減少材料的數(shù)量; 根據(jù)材料類型選擇合適勻漿方法; 組織樣本適宜切成小塊后，在Trizol試劑中均質(zhì)，充分裂解。

        原因3：用于分光光度分析的稀釋液PH值太低

        解決：使用TE（PH 8.0）作為稀釋液進行讀數(shù)測定。

        2、RNA降解

        問題1：RNA酶污染

        解決：戴上手套操作，勤換手套; 耗材與試劑均應作RNase-free處理; 操作中減少EP管的開蓋次數(shù)與時間。

        問題2：樣品處理不當

        解決：新鮮組織收獲后，立即凍結在-70℃或液氮中; 也可以在Trizol試劑中均質(zhì)后，-70℃下儲存。

        3、Abs260/Abs280比值低

        問題1：酸性pH降低吸光度比率

        解決：使用TE緩沖液(pH 8.0)作為稀釋液進行測定。

        問題2：水相被酚相污染

        解決：小心轉(zhuǎn)移上層水相，避免吸入中間相，可留少許上層相不吸取。

        4、DNA 污染

        問題1：Trizol加少了，造成DNA /核蛋白復合物與RNA水相分離不完全

        解決：適當選擇起始材料的量，加入合適體積的裂解液。

        問題2：水相被苯酚相污染

        解決：小心轉(zhuǎn)移上層水相，避免吸入中間相，可留少許上層相不吸取。

        5、下游反應中RNA表現(xiàn)不佳

        問題1：乙醇或鹽類污染

        解決：溶解RNA之前，注意洗滌沉淀，并通過空離和風干除去殘留。

        6、熔解曲線有雜峰

        問題1：引物二聚體

        解決：

        （1）提高退火溫度

        （2）降低引物濃度，甚至調(diào)整正向引物和反向引物的比例。 一般引物最終濃度設定為200 nM，但如有必要，可降低至60 nM。

        （3）鎂離子的濃度最好在3 mM左右。 高于這個濃度，引物二聚體更易形成;

        （4）重新設計引物并評估它們的二聚化傾向。

        問題2：非特異性擴增

        解決：重新設計引物并通過預實驗評估特異性。

        問題3：cDNA模板降解

        解決：模板避免反復凍融，可適當分裝保存，每次取用一小管。

        7、無擴增信號

        原因：低表達，反轉(zhuǎn)錄，或定量儀器問題

        好啦！那實時熒光定量PCR實驗常見問題及其解決方法咱們就分享到這里啦！希望能幫到大家哦，如果您遇到了更多解決不了的問題或需要外包實時熒光定量PCR實驗，歡迎隨時留言哦~咱們下期見！