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Tunel染色實(shí)操注意事項(xiàng)由普拉特澤生物——病理實(shí)驗(yàn)平臺(tái)技術(shù)為大家總結(jié)分享。Tunel是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，能準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞和組織凋亡的典型生物化學(xué)和形態(tài)特征，普拉特澤生物承接細(xì)胞、組織樣本細(xì)胞凋亡檢測(cè)外包幾百例，總結(jié)出操作過(guò)程中容易被實(shí)驗(yàn)員忽略的注意事項(xiàng)，分享給大家：

1、Tunel檢測(cè)固定注意事項(xiàng)

（1）固定液建議使用4%的多聚甲醛（PBS）進(jìn)行固定，不建議選用乙醇和甲醇，也不能選用甲醛替代，因?yàn)槭忻嫔腺?gòu)買得到的甲醛大多含有甲醇。這會(huì)使我們后續(xù)的染色過(guò)程中標(biāo)記效率降低，難以觀察到熒光。

（2）固定液的濃度不可過(guò)高，濃度過(guò)高的固定液會(huì)使組織邊緣迅速固定，影響液體的穿透，影響固定效果，導(dǎo)致組織中心的細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂等情況的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。

（3）固定時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，太長(zhǎng)的固定時(shí)間會(huì)影響試劑的染色效率。

2、Tunel檢測(cè)需充分脫蠟水化

脫蠟可以先 60°C 20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻。

3、Tunel檢測(cè)孵育注意事項(xiàng)

一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時(shí)間；幾十 μm 切片用長(zhǎng)時(shí)間，通過(guò)摸索達(dá)到既不脫片，又能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的假陽(yáng)性也可能與Tunel染色孵育步驟有關(guān)，Tunel染色液孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)出現(xiàn)非特異性熒光。

4、適當(dāng)延長(zhǎng)Tunel反應(yīng)液的時(shí)間

一般是37°c 1 h，也可以根據(jù)細(xì)胞凋亡損傷程度，選擇更長(zhǎng)的時(shí)間，可長(zhǎng)至 2 h，但要結(jié)合你最終的背景著色。

5、Tunel檢測(cè)操作避光

熒光在普通光照下不能長(zhǎng)時(shí)間保持熒光，所以，在進(jìn)行需要避光操作的步驟時(shí)，我們要嚴(yán)格進(jìn)行避光操作，避免熒光淬滅導(dǎo)致不能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有準(zhǔn)確判斷。

6、Tunel檢測(cè)輕柔操作

貼壁細(xì)胞在加藥誘導(dǎo)凋亡后，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞形態(tài)皺縮邊緣，其貼壁粘附力降低。在對(duì)此細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)染色時(shí)，需要小心操作，避免吹打造成的細(xì)胞脫落，尤其是我們?cè)趯?duì)細(xì)胞的多次洗滌時(shí)操作更要小心輕柔。

7、Tunel檢測(cè)曝光注意事項(xiàng)

在進(jìn)行熒光顯微鏡觀察時(shí)，根據(jù)顯微鏡的不同，具體參數(shù)曝光時(shí)間建議在1000ms以內(nèi)，增益參數(shù)建議在500%以內(nèi)，或不開(kāi)增益曝光時(shí)間控制再2000ms以內(nèi)，過(guò)度曝光也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性。

好啦，Tunel染色操作時(shí)的注意事項(xiàng)咱們就介紹完啦，希望能夠在實(shí)際的操作中真正幫助到您，得到一個(gè)清晰漂亮好分辨的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)然您若是有Tunel染色實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞凋亡檢測(cè)外包與代做的需求的話，歡迎直接留言，普拉特澤生物隨時(shí)在線。

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