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普拉特澤生物承接考馬斯亮藍(lán)染色等病理染色相關(guān)服務(wù)上萬(wàn)例，積累了操作大量經(jīng)驗(yàn)，為大家詳細(xì)介紹考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白濃度步驟
同時(shí)為廣大科研工作者開(kāi)展線上的理論培訓(xùn)與線下實(shí)操
可承接染色實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)。

1.準(zhǔn)備試劑與器材

?考馬斯亮藍(lán)G-250試劑?：通常是將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL的95%乙醇中，再加入適量的85%磷酸，最后用蒸餾水稀釋至1L。具體配比可能因?qū)嶒?yàn)需求而略有不同。

?標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液?：常用牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配制成一定濃度的溶液，如1mg/mL或100μg/mL，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

?分光光度計(jì)?：用于測(cè)定染色后溶液在595nm處的吸光度值。

?試管、移液器、渦旋混勻器等?：用于溶液的配制、混合和測(cè)定。

2.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

①配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液?：取一系列潔凈的試管，分別加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和蒸餾水，使各試管中蛋白濃度呈梯度分布。

?②加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑?：向各試管中加入等體積的考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，并充分混勻。

?③測(cè)定吸光度值?：使用分光光度計(jì)，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。

④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)呈線性關(guān)系，以便后續(xù)計(jì)算待測(cè)蛋白濃度。

3.測(cè)定待測(cè)蛋白濃度

?①稀釋待測(cè)蛋白溶液?：根據(jù)待測(cè)蛋白的預(yù)估濃度，將其稀釋至適當(dāng)范圍，使測(cè)定值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

②加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑?：向稀釋后的待測(cè)蛋白溶液中加入等體積的考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，并充分混勻。

?③測(cè)定吸光度值?：同樣使用分光光度計(jì)，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定待測(cè)蛋白溶液的吸光度值。

?④計(jì)算待測(cè)蛋白濃度?：根據(jù)測(cè)得的吸光度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出待測(cè)蛋白的濃度。

4.注意事項(xiàng)

?⑴試劑配制?：考馬斯亮藍(lán)G-250試劑的配制需準(zhǔn)確，避免濃度過(guò)高或過(guò)低影響測(cè)定結(jié)果。

?⑵溶液混合?：在加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑后，應(yīng)充分混勻溶液，確保染料與蛋白充分結(jié)合。

?⑶測(cè)定時(shí)間?：在加入試劑后，應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定，避免顏色變化導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

⑷儀器校準(zhǔn)?：使用分光光度計(jì)前，應(yīng)進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

通過(guò)以上步驟，即可利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的蛋白質(zhì)定量方法之一。

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