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克隆形成
【應(yīng)用簡介】
克隆形成及細(xì)胞克隆接種存活率，通過觀察單細(xì)胞集落形成情況，來計(jì)算克隆形成率，了解其增殖能力。
【技術(shù)原理】
單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上時(shí)細(xì)胞數(shù)量已達(dá)60個(gè)左右，此細(xì)胞群體成為克隆或集落，大小在1.0-2.0 mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨(dú)立生存能力，各種理化因素可能導(dǎo)致細(xì)胞的克隆形成能力發(fā)生改變，通過計(jì)數(shù)克隆形成率，可對單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力做定量分析，了解細(xì)胞的增殖率和對生存環(huán)境的適應(yīng)性。軟瓊脂培養(yǎng)或平板克隆是最常用的方法。
【實(shí)驗(yàn)方法】
Step1：細(xì)胞培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)
Step2：制備單細(xì)胞懸液
Step3：按不同的細(xì)胞濃度梯度把細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)平板
Step4：培養(yǎng)一段時(shí)間
Step5：觀察克隆情況，固定染色后計(jì)算克隆形成率
案例展示
不同腫瘤細(xì)胞的平板克隆
技術(shù)總結(jié)
1、對數(shù)生長期，細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下，0.25%胰酶消化，離心后重懸時(shí)一定要吹打成單細(xì)胞懸液?？梢赃x擇6孔板作為克隆培養(yǎng)板，按密度梯度（如100、200、300）接種進(jìn)孔板中。接種后切記晃動平板，使細(xì)胞分布均勻。
2、培養(yǎng)2周左右（出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞集落時(shí)），即可固定染色。加固定液和染色液時(shí)，覆蓋住孔板底層即可。但如果長時(shí)間不處理，需增加液體量，防止液體干涸，影響拍照效果。
3、拍照時(shí)，務(wù)必使每個(gè)孔中無陰影，如無法達(dá)到，則逐個(gè)孔進(jìn)行拍照。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細(xì)胞 | 1.取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化離心收集細(xì)胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標(biāo)明細(xì)胞名稱/細(xì)胞代數(shù)，凍存細(xì)胞數(shù)量在1-5*106個(gè)/ml。 2.項(xiàng)目啟動后細(xì)胞復(fù)蘇，復(fù)蘇后3天反饋細(xì)胞狀態(tài)，3-5天反饋細(xì)胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細(xì)胞詳細(xì)信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 復(fù)蘇后細(xì)胞 | 1.使用T25培養(yǎng)瓶運(yùn)輸。細(xì)胞匯合度達(dá)到60%以上，裝滿培養(yǎng)液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標(biāo)明細(xì)胞名稱/細(xì)胞代數(shù)/接種時(shí)間/培養(yǎng)基類型，瓶子固定運(yùn)輸。 2.收到細(xì)胞后3天反饋細(xì)胞狀態(tài)，3-5天反饋細(xì)胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細(xì)胞詳細(xì)信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質(zhì)粒 | 1.純度高，無內(nèi)毒素，無蛋白質(zhì)，基因組DNA/RNA污染，質(zhì)粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內(nèi)毒素處理 3. 載體詳細(xì)信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標(biāo)記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時(shí)間，且沒有反復(fù)凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時(shí)間，且沒有反復(fù)凍融 3.明確是否表達(dá)熒光標(biāo)簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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