外泌體提取
外泌體（Exosome）是由活細(xì)胞分泌的直徑約為30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)；存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清、血漿、唾液、尿液、羊水以及其它生物體液中；外泌體攜帶有多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA等重要信息，不僅在細(xì)胞與細(xì)胞間的物質(zhì)和信息傳遞中起重要作用，更有望成為多種疾病的早期診斷標(biāo)志物。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
基于SEC+超濾的外泌體分離方法，可方便快捷進(jìn)行高純度及高回收率的外泌體分離。以熒光外泌體作為標(biāo)準(zhǔn)品，Exosupur可回收94.87%的熒光外泌體；能夠去除99.44%的血漿游離雜蛋白，如主要的miRNA結(jié)合蛋白Ago、血漿雜蛋白HAS在Exosupur中更少；跟超離及市面常見(jiàn)試劑盒相比，該方法提取的外泌體的particle數(shù)與蛋白含量比值更高，表明分離得外泌體純度更高，雜蛋白含量更低。
此方法可以得到更高豐度的長(zhǎng)鏈RNA，在外泌體lncRNA含量較低的情況下，更有利于mRNA +LncRNA的研究；Exosupur富集到的外泌體更純，能更準(zhǔn)確地分析外泌體來(lái)源miRNA。
通過(guò)酶消化試驗(yàn)，證明得到的RNA更多的是來(lái)源于囊泡，而非游離RNA。
案例展示
技術(shù)總結(jié)
【注意事項(xiàng)】
1、根據(jù)樣本的不同，選用不同的外泌體提取方法；
2、避免外泌體中內(nèi)容物降解好變性，所有操作盡量在4℃條件下進(jìn)行；
3、避免外泌體膜結(jié)構(gòu)破壞，操作中盡量減少外泌體的壓力和剪切力，比如使用鈍化的槍頭等。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
【送檢標(biāo)準(zhǔn)】
（一）、血漿樣本采集
1、請(qǐng)用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)4 h）；
2、將采集到的血液在4℃下1500g，離心20min，去除血液中的細(xì)胞；
3、取上清，4℃下3000g，離心15min，收集上清（血漿），-80℃保存。
4、送樣量： 排阻+超濾 4mL（夠2次分離）
超離 4mL
注意事項(xiàng)：① 請(qǐng)勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放；② 請(qǐng)排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。
（二）、血清樣本采集
1、請(qǐng)用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)4 h）；
2、將采集到的血液在4℃下1500g，離心20min，去除血液中的細(xì)胞；
3、取上清，4℃下13000g，離心2min，收集上清（血清），-80℃保存。
4、送樣量： 超離 4 mL
排阻+超濾 1mL
注意事項(xiàng)：請(qǐng)排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。
（三）、尿液樣本采集
1、采集前/中后段晨尿約60mL，若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)8 h）；
2、將采集到的尿液在4℃下（室溫亦可）離心2000g，20min，去除尿液中的細(xì)胞；-80℃保存；
3、送樣量：60 mL。
注意事項(xiàng)：請(qǐng)務(wù)必囑咐患者，①采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；②中段尿請(qǐng)務(wù)必去掉最初排出的50-80 mL尿液；③女性受試者，請(qǐng)于采尿前對(duì)外陰進(jìn)行清洗。
（四）、胸水樣本采集
1、臨床收集胸水后若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)8 h）；
2、將收集到的胸水1000g 離心10min，收集上清液；
3、將得到的胸水上清3000g 離心10min，收集上清，-80℃保存。
4、送樣量：30 mL
（五）、腹水樣本采集
1、臨床收集腹水后若不能第一時(shí)間處理，請(qǐng)于4℃臨時(shí)保存（不得超過(guò)8 h）；
2、將采集到的腹水在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20 min，去除腹水中的殘?jiān)?80℃保存；
3、送樣量：30 mL。
（六）、腦脊液樣本采集
1、采集方式為腰椎穿刺，樣本一經(jīng)分離，請(qǐng)務(wù)必立即置于冰上或4℃短暫保存（不得超過(guò)4 h），采樣時(shí)注意避免血液污染；
2、樣本室溫下2000g 離心20min去除細(xì)胞及部分碎片，取上清，-80℃保存；
3、送樣量：5 mL。
注意事項(xiàng)：請(qǐng)勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放。
（七）、膽汁樣本采集
1、用無(wú)菌容器收集膽汁；
2、將收集到的膽汁在4℃下，3000g 離心10min 去除細(xì)胞沉渣和碎片；
3、收集膽汁上清液，4℃或者-20℃長(zhǎng)期保存；
4、送樣量：5 mL。
（八）、細(xì)胞樣本采集
對(duì)于耐受無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞的處理流程：
1、細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)于貼壁細(xì)胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細(xì)胞2-3遍去除殘留牛血清，添加無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
2、上清收集：細(xì)胞上清先用200-300g 離心10min，再用3000g 離心10min，最后0.22um過(guò)膜或者10000g 離心30min。將處理后的細(xì)胞上清經(jīng)100kd超濾管超濾濃縮（詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)2.1）；
3、儲(chǔ)存運(yùn)輸：將處理好的細(xì)胞上清收集在無(wú)菌培養(yǎng)瓶，-80保存或者干冰運(yùn)輸，體積需求細(xì)胞上清原液大于200ml（對(duì)應(yīng)于10cm的大皿，至少需要20大皿）；
4、對(duì)于一些狀態(tài)良好的細(xì)胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結(jié)果。
對(duì)于不耐受無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞的處理流程：
1、細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)于貼壁細(xì)胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細(xì)胞2-3遍去除殘留牛血清，添加含5%無(wú)外泌體血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
2、上清收集：細(xì)胞上清先用200-300g 離心10min，再用3000g 離心10min，最后0.22um 過(guò)膜或者10000g 離心30min。將處理后的細(xì)胞上清經(jīng)100kd超濾管超濾濃縮（詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)2.1）；
3、儲(chǔ)存運(yùn)輸：將處理好的細(xì)胞上清收集在無(wú)菌培養(yǎng)瓶，-80保存或者干冰運(yùn)輸，體積需求細(xì)胞上清原液大于200ml（對(duì)應(yīng)于10cm的大皿，至少需要20大皿）；
4、對(duì)于一些狀態(tài)良好的細(xì)胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結(jié)果。
5、送樣量：細(xì)胞上清原液建議大于200 mL。
注：細(xì)胞上清樣本按照送樣體積收費(fèi)，超濾濃縮步驟可選擇自己完成也可直接送公司完成。
參考文獻(xiàn)：Rong Xu, David W. Greening , Alin Rai, Hong Ji, Richard J. Simpson. Highly-purified exosomes and shed microvesicles isolated from the human colon cancer cell line LIM1863 by sequential centrifugal ultrafiltration are biochemically and functionally distinct. Methods. 2015 .1;87:11-25
【交付標(biāo)準(zhǔn)】
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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