CCK8/mtt/細胞增殖檢測
MTT，CCK-8，BrdU，EdU等方法是常見的細胞增殖檢測技術(shù)，分別從代謝活性和DNA合成的角度來反應(yīng)細胞的增殖情況。MTT和CCK-8檢測原理為活細胞線粒體中的一些脫氫酶能使檢測試劑還原為甲瓚，而死細胞無此功能。BrdU和EdU則能都在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過基于與熒光染料的特異性反應(yīng)檢測DNA復(fù)制活性。
相關(guān)實驗
實驗承諾函
咨詢記錄
技術(shù)文章
城市
時間
福建省福州市
2026-01-03 14:54:11
北京市
2026-01-03 12:59:19
江蘇省南通市
2026-01-03 12:38:26
江蘇省南通市
2026-01-02 19:38:03
浙江省麗水市
2026-01-02 13:48:20
江蘇省鎮(zhèn)江市
2026-01-02 11:38:19
浙江省杭州市
2026-01-02 04:38:34
遼寧省沈陽市
2026-01-01 22:52:28
四川省
2026-01-01 22:29:36
浙江省湖州市
2026-01-01 14:23:47
實驗介紹
【應(yīng)用簡介】
細胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)，與細胞凋亡、細胞周期等是腫瘤研究的重要表型，同時也是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究的重要內(nèi)容。MTT或CCK8是檢測細胞增殖的常用手段，可研究藥物對細胞的毒性作用；或探究過表達或干擾細胞中某個基因?qū)毎鲋衬芰Φ挠绊?，為進一步研究基因的功能提供依據(jù)等。
【MTT技術(shù)原理】
MTT(噻唑藍)，可透過細胞膜進入細胞內(nèi)，活細胞線粒體中的脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結(jié)晶并沉積在細胞中，而死細胞無此功能；結(jié)晶物能溶于DMSO中，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，間接反映活細胞數(shù)量（一定范圍內(nèi)，OD值越大，細胞活性越強）。
【CCK8技術(shù)原理】
CCK-8試劑中的WST-8，可在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物；用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞量（一定范圍內(nèi)生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比）。
【實驗方法】
Step1：細胞培養(yǎng)及狀態(tài)調(diào)整；
Step2：鋪板；
Step3：過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁及穩(wěn)定；
Step4：藥物處理；
Step5：MTT呈色：避光加MTT溶液，37℃孵育4 h，孵育完成后除盡孔內(nèi)上清，每孔加150μL DMSO，振蕩10min；
CCK-8呈色：避光加CCK-8溶液，孵育37℃ 1-4 h；
Step6：上機檢測：MTT-490nm；CCK8-450nm；
Step7：分析數(shù)據(jù)：以O(shè)D值或細胞相對存活率作圖。
注：如研究某基因?qū)?/span>胞增殖能力的影響，采取先轉(zhuǎn)染后鋪板的原則。
案例展示
案例一：細胞相對存活率%
注：相對存活率%=（實驗組OD值-調(diào)零孔OD值）/（空白組OD值-調(diào)零孔OD值）×100
*表示實驗組與其對照組比較差異顯著（ 0.01＜P＜0.05）
**表示實驗組與其對照組比較差異極顯著（P＜0.01）
結(jié)果分析：
1、空載對照組與空白組無顯著差異，表明載體正常，對細胞增殖無明顯影響。
2、過表達X基因可促進目的細胞的增殖，與對照組相比差異顯著。
案例二：IC50：指某一藥物或者物質(zhì)(抑制劑)在抑制某些生物程序（如酶、細胞受體、微生物）的半量，即50%抑制濃度。
結(jié)果分析：
1、當(dāng)A藥物處理目的細胞24h時，藥物的半數(shù)抑制濃度為31.39μg/mL；
2、當(dāng)A藥物處理目的細胞48h時，藥物的半數(shù)抑制濃度為9.98μg/mL。
技術(shù)總結(jié)
【常見問題及注意事項】
1、鋪板密度不合理，均勻度不一致；
2、實驗分組不嚴謹；
3、實驗設(shè)置時間點不合理；
4、MTT或CCK8加樣時注意事項不明確；
5、血清等影響：高濃度血清或藥物顏色會影響試驗孔的吸光度值；
6、邊緣效應(yīng)：邊緣孔的水分揮發(fā)較快，藥物易被濃縮。
送檢與交付標(biāo)準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細胞 | 1.取對數(shù)生長期的細胞，消化離心收集細胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標(biāo)明細胞名稱/細胞代數(shù)，凍存細胞數(shù)量在1-5*106個/ml。 2.項目啟動后細胞復(fù)蘇，復(fù)蘇后3天反饋細胞狀態(tài)，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 復(fù)蘇后細胞 | 1.使用T25培養(yǎng)瓶運輸。細胞匯合度達到60%以上，裝滿培養(yǎng)液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標(biāo)明細胞名稱/細胞代數(shù)/接種時間/培養(yǎng)基類型，瓶子固定運輸。 2.收到細胞后3天反饋細胞狀態(tài)，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件等，如經(jīng)過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質(zhì)粒 | 1.純度高，無內(nèi)毒素，無蛋白質(zhì)，基因組DNA/RNA污染，質(zhì)粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內(nèi)毒素處理 3. 載體詳細信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標(biāo)記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時間，且沒有反復(fù)凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標(biāo)明制備時間，且沒有反復(fù)凍融 3.明確是否表達熒光標(biāo)簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號
湘公網(wǎng)安備