ko技術(shù)服務(wù)
RNP（核糖核蛋白復(fù)合物）法 KO 穩(wěn)株服務(wù)，是將預(yù)先組裝好的 Cas9 蛋白與向?qū)?RNA（gRNA）形成的 RNP 復(fù)合物，通過電穿孔技術(shù)精準(zhǔn)導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)特定基因穩(wěn)定敲除（KO）的專業(yè)服務(wù)。我們依托優(yōu)化的 RNP 組裝體系與高效電轉(zhuǎn)平臺(tái)，針對(duì)客戶需求設(shè)計(jì)個(gè)性化方案，構(gòu)建遺傳背景清晰、表型穩(wěn)定的 KO 細(xì)胞株，為科研與藥物研發(fā)提供核心實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?
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什么是 RNP 法KO細(xì)胞株服務(wù)？
RNP（核糖核蛋白復(fù)合物）法 KO 穩(wěn)株服務(wù)，是將預(yù)先組裝好的 Cas9 蛋白與向?qū)?RNA（gRNA）形成的 RNP 復(fù)合物，通過電穿孔技術(shù)精準(zhǔn)導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)特定基因穩(wěn)定敲除（KO）的專業(yè)服務(wù)。我們依托優(yōu)化的 RNP 組裝體系與高效電轉(zhuǎn)平臺(tái)，針對(duì)客戶需求設(shè)計(jì)個(gè)性化方案，構(gòu)建遺傳背景清晰、表型穩(wěn)定的 KO 細(xì)胞株，為科研與藥物研發(fā)提供核心實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/span>
RNP 復(fù)合物組裝：將高活性 Cas9 蛋白與靶向目標(biāo)基因的特異性 gRNA 在體外進(jìn)行組裝，形成具有高度靶向性的編輯復(fù)合物。
電穿孔導(dǎo)入：利用電轉(zhuǎn)儀產(chǎn)生的瞬時(shí)電場(chǎng)在細(xì)胞膜上形成微孔，使 RNP 復(fù)合物高效進(jìn)入細(xì)胞，相比傳統(tǒng)病毒轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，大幅提升編輯效率與細(xì)胞存活率。
精準(zhǔn)基因敲除：進(jìn)入細(xì)胞的 RNP 復(fù)合物快速識(shí)別靶基因序列并切割，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性 DNA 修復(fù)機(jī)制（非同源末端連接 NHEJ），最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的穩(wěn)定敲除。
低脫靶保障：RNP 復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)半衰期短（24-48 小時(shí)），可快速降解，顯著降低長(zhǎng)期表達(dá)導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)，同時(shí)避免外源基因整合帶來的基因組干擾
超高精準(zhǔn)性：RNP 復(fù)合物直接作用于靶序列，無外源 DNA 整合，結(jié)合短半衰期特性。
高效轉(zhuǎn)染：電轉(zhuǎn)技術(shù)適配多種難轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如免疫細(xì)胞），高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。
快速交付：優(yōu)化的 RNP 組裝-電轉(zhuǎn)-篩選流程，無需等待蛋白表達(dá)，穩(wěn)株構(gòu)建周期縮短至8-12周。
細(xì)胞友好：低電壓脈沖設(shè)計(jì)減少細(xì)胞損傷，適合珍貴細(xì)胞樣本。
廣泛適用：覆蓋腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞（如 T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞）等 200 + 細(xì)胞類型。
標(biāo)準(zhǔn)化服務(wù)流程
1. 需求定制：深入溝通客戶研究目標(biāo)（如基因功能、藥物篩選）、靶基因信息及細(xì)胞特性（如細(xì)胞系 / 難轉(zhuǎn)染程度），提供全面的可行性評(píng)估報(bào)告與個(gè)性化方案。
2. RNP 設(shè)計(jì)與組裝：根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)2條高特異性 gRNA。
3. 細(xì)胞電轉(zhuǎn)與培養(yǎng)：將 RNP 復(fù)合物通過電轉(zhuǎn)入細(xì)胞，置于專用培養(yǎng)體系中恢復(fù)培養(yǎng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)。
4. 單克隆篩選與鑒定：采用流式細(xì)胞分選獲得單克隆細(xì)胞，通過 PCR 擴(kuò)增靶基因片段、Sanger 測(cè)序驗(yàn)證敲除效率，篩選純合子克隆。
5. 交付與售后：交付合格 KO 細(xì)胞株（含凍存管2支）、完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含 gRNA 序列、測(cè)序結(jié)果），提供 1 個(gè)月技術(shù)支持，解答后續(xù)培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)疑問。
1. 基因型驗(yàn)證：采用Sanger 測(cè)序確認(rèn)靶基因敲除類型（移碼突變 / 片段缺失）
2. 細(xì)胞質(zhì)控：
(1) 支原體檢測(cè)：PCR 法檢測(cè)支原體，結(jié)果陰性方可交付。
(2) 追溯體系：每批次實(shí)驗(yàn)保留檢測(cè)原始數(shù)據(jù)，支持結(jié)果溯源與重復(fù)驗(yàn)證。
(3) 表型驗(yàn)證：可根據(jù)客戶需求，加做細(xì)胞增殖（CCK-8）、凋亡（流式 Annexin V）、功能標(biāo)志物表達(dá)（Western Blot / 流式）等表型變化檢測(cè)服務(wù)。
1. 基因功能研究：構(gòu)建特定基因 KO 穩(wěn)株，通過對(duì)比野生型與 KO 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組、代謝組差異，解析基因在細(xì)胞周期、信號(hào)通路、疾病發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制。
2. 腫瘤研究與藥物篩選：針對(duì)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因（如 EGFR、KRAS）構(gòu)建 KO 穩(wěn)株，用于驗(yàn)證藥物靶點(diǎn)有效性，或篩選靶向該基因的小分子藥物、抗體藥物。
3. 細(xì)胞治療研發(fā)：在 CAR-T 細(xì)胞、iPSC 等細(xì)胞治療領(lǐng)域，通過 RNP 電轉(zhuǎn)敲除 PD-1、TCR 等基因，增強(qiáng)細(xì)胞治療效果，降低免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)。
4. 傳染病研究：敲除病毒受體基因（如 ACE2、CD4）構(gòu)建抗病毒細(xì)胞模型，用于病毒入侵機(jī)制研究及抗病毒藥物篩選。
5. 遺傳病模型構(gòu)建：模擬人類遺傳病相關(guān)基因突變（如囊性纖維化 CFTR 基因、鐮狀細(xì)胞貧血 HBB 基因），建立 KO 細(xì)胞模型，助力發(fā)病機(jī)制研究與基因治療方案開發(fā)。
某三甲醫(yī)院腫瘤研究所需構(gòu)建結(jié)直腸癌細(xì)胞KO細(xì)胞株（靶基因?yàn)?/span>NPSR1），傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率不足30%。我們采用RNP電轉(zhuǎn)法，優(yōu)化參數(shù)后轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%，8周成功交付KO單克隆純合子，經(jīng)團(tuán)隊(duì)后期Western blot檢測(cè)，NPSR1基因敲除率100%。
某高校附屬醫(yī)學(xué)院肝病研究所需敲除原代肝癌細(xì)胞中的UPG基因以進(jìn)行藥篩。我們通過設(shè)計(jì)2條gRNA與Cas9蛋白組裝，并使用RNP電轉(zhuǎn)法在原代肝癌細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了UPG基因的雜合敲除，單克隆細(xì)胞存活率100%。
某高校發(fā)育生物學(xué)團(tuán)隊(duì)需在小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系（Raw264.7）中敲除EGR1基因，由于細(xì)胞半懸浮半貼壁生長(zhǎng)，傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及慢病毒法敲除效率低、周期長(zhǎng)，我們采用低損傷RNP電轉(zhuǎn)方案，設(shè)計(jì)3條sgRNA，最終獲得 EGR1 KO細(xì)胞池（多克?。?，團(tuán)隊(duì)繼續(xù)進(jìn)行單克隆篩選。
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