EMSA
研究啟動子結(jié)合蛋白的經(jīng)典方法，是一種用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技術(shù)。目前用于檢測DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白，并可通過加入特異性抗體來檢測特定的蛋白質(zhì)，結(jié)合蛋白雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行未知蛋白的鑒定分析。
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實驗介紹
【技術(shù)原理及背景】
研究啟動子結(jié)合蛋白的經(jīng)典方法，是一種用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技術(shù)，其基本原理是末端標(biāo)記的核酸探針可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，電泳時這種復(fù)合物相對沒有結(jié)合蛋白的探針在凝膠中移動的速度慢，即表現(xiàn)為相對滯后。該方法不僅簡單迅速且靈敏度高；另一方面它可以用競爭性試驗來評價蛋白和核酸結(jié)合的特性。目前用于檢測DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白，并可通過加入特異性抗體來檢測特定的蛋白質(zhì)，結(jié)合蛋白雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行未知蛋白的鑒定分析。
【技術(shù)應(yīng)用】
1. 用于檢測某一特定的DNA或RNA序列與某一個特定的蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用關(guān)系。
2. 用于驗證預(yù)測結(jié)合的核苷酸序列。
【實驗原理】
案例展示
實驗優(yōu)缺點
優(yōu)勢：
1. 可用目的蛋白的重組蛋白與DNA或RNA探針進(jìn)行驗證，避免非常規(guī)物種缺少抗體的困擾。
2. 是用于驗證反式作用因子（如轉(zhuǎn)錄因子）與正式作用元件（如啟動子）結(jié)合的經(jīng)典技術(shù)。
3. 可定義核酸序列與蛋白質(zhì)的直接互作關(guān)系。
4. 可分析結(jié)合位點（設(shè)計野生型及突變型探針）。
不足：
1. 探針為人工合成，無法完全模擬特定生理狀態(tài)下的結(jié)合。
2. 如果是用于檢測轉(zhuǎn)錄因子活性，無法判斷結(jié)合啟動子后對靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。
3. 必須已知DNA或RNA序列，才能設(shè)計探針。
送檢及交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實驗要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實驗，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實驗，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號
湘公網(wǎng)安備