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實驗介紹
【技術原理】
原位雜交（in situ hybridization）是應用已知堿基順序并帶有標記的核酸探針與組織、細胞等樣本中待測目的基因按堿基配對原則進行特異性結合而形成的雜交體，然后再用與標記物相應的檢測方法，在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，從而在顯微鏡下進行目的基因的定位檢測觀察。主要檢測方法分為DAB顯色和熒光顯色兩種。
【實驗流程】
案例展示
組織的miRNA原位雜交
技術總結
【常見問題】
1、RNA探針長度以50-150bp為佳，探針已進入細胞，雜交率高，雜交時間短。
2、原位雜交反應中探針濃度應超過靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實驗最大信噪比，因為背景著色度高低與探針濃度有關。
3、雜交溫度應低于解鏈或溶解溫度20-30℃。雜交反應的時間可隨探針濃度的增加而縮短，雜交時間過短會造成雜交不完全，雜交時間過長會增加非特異性著色。
4、組織固定或蔗糖脫水不好會使組織有較多的空泡。
【注意事項】
1、固定液的選擇及固定時間
石蠟組織建議用10%中性緩沖福爾馬林（含1/1000 DEPC）固定1～24h，其它固定液對實驗結果可能產生一定的影響。
2、組織切片和載玻片的選擇
組織切片4～5μm 厚，過厚或過薄的切片均會對信號的強弱產生影響，而且切片應完整，質量良好，否則會在預處理時掉片。載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。
3、實驗過程中切片的預處理
切片預處理過程包括煮沸處理和蛋白酶消化。當組織處理不規(guī)范、切片過厚或烤片不足時，在煮沸過程中容易掉片，建議烤片溫度在56℃過夜。煮沸過程中要嚴格控制實驗溫度和時間。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 新鮮組織 | 新鮮取材組織，用 PBS 清洗干凈血液等，立即-80℃保存 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 一般固定組織 | 一般組織體積不超過2cmX2cmX0.5cm，固定時盡量保持組織的原有形態(tài)并清理干凈血液及多余部分，如腸道內容物；固定液體積為組織大小的10倍以上，容器足夠容納組織不使其擠壓變形。標注好固定液類型和固定時長 | 常溫 | 常溫 | |
| 特殊固定組織 | 睪丸、眼球、脊髓、肌肉等組織：推薦使用對應的特殊固定液進行固定，以保證固定效果。如Bouin液，適用于睪丸組織、皮膚組織及眼球的固定 | |||
| 組織蠟塊 | 組織由標準的石蠟包埋盒包埋（尺寸為30*24*7mm），石蠟與組織要均勻接合，不能有裂痕；蠟塊厚度根據(jù)所需切片的數(shù)量而定，有效厚度至少要超過 0.1cm。盡量提供半年內的組織蠟塊，超過半年的蠟塊抗原可能丟失，做免疫組化可能出現(xiàn)檢測不到蛋白。 | 常溫 | 常溫 | |
| 組織切片 | 需用防脫載玻片進行撈片，并注明切片厚度、已烤片溫度與時間，組織應在靠近切片下端 1/3 處。 | 4℃ | 冰袋 | |
| 細胞爬片 | 使用 12 孔板或 24 孔板專用細胞爬片，細胞爬片經固定后用 PBS 洗滌 2~3 次，保存在 PBS 中，用封口膜密封孔板。每個爬片在孔板蓋上應有唯一的標記，并有電子版的分組信息，以防標記在運輸途中模糊。 | 常溫 | 常溫 | |
| 植物樣本 | 新鮮組織FAA固定，木質化程度不高；對于較薄的葉片，如果要求平行葉片切片，難以保證切完整；根莖要求直徑>1mm | 常溫 | 常溫 | |
| 抗體 | 保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記，并附帶說明書，抗體的量應大于實驗所需的量。組織切片、組織芯片按稀釋后 100μl 一張切片計算抗體用量， 24 孔板細胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 200μl 一張計算抗體用量，12 孔板細胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 400μl 一張計算抗體用量。 | -20℃ | 冰袋或干冰 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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