shRNA載體構(gòu)建
首先設(shè)計(jì)根據(jù)需求設(shè)計(jì)shRNA引物一套，完成引物退火。將載體進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，雙酶切后割膠回收。將shRNA和雙酶切回收后的載體，使用試劑盒進(jìn)行重組成環(huán)狀片段，轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆菌落送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的shRNA表達(dá)載體。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
首先設(shè)計(jì)根據(jù)需求設(shè)計(jì)shRNA引物一套，完成引物退火。將載體進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，雙酶切后割膠回收。將shRNA和雙酶切回收后的載體，使用試劑盒進(jìn)行重組成環(huán)狀片段，轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆菌落送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的shRNA表達(dá)載體。
shRNA的靶點(diǎn)選擇決定著對(duì)靶向基因的表達(dá)敲低效果，通常涉及3-4個(gè)shRNA靶點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)后續(xù)檢測(cè)結(jié)果確定最佳靶點(diǎn)后，安排后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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