支原體檢測(cè)
支原體是細(xì)胞外生存的最小微生物，是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。通過(guò)對(duì)支原體特定的序列設(shè)計(jì)引物，當(dāng)存在支原體污染時(shí)通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增，會(huì)將目標(biāo)DNA特異性地復(fù)制，然后通過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)，會(huì)跑出條帶出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。反之當(dāng)沒(méi)有支原體污染時(shí)，由于沒(méi)有模板，PCR無(wú)法擴(kuò)增，則瓊脂糖電泳跑不出條帶，出現(xiàn)陰性結(jié)果。
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【實(shí)驗(yàn)原理】
原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很大。這個(gè)間隔區(qū)的 DNA序列及長(zhǎng)度在 Mycoplasma 各個(gè)種間既有相對(duì)保守的部分，也有具有很大差異的部分。本制品是在編碼 16S 和 23S rRNA 的 DNA 上設(shè)計(jì)一對(duì) F1/R1 引物，擴(kuò)增編碼 16S 和 23S rRNA 的 DNA 間隔區(qū)。此反應(yīng)體系只特異性擴(kuò)增 Mycoplasma DNA，檢出靈敏度與特異性都很高。
通過(guò)對(duì)支原體特定的序列設(shè)計(jì)引物，當(dāng)存在支原體污染時(shí)通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增，會(huì)將目標(biāo)DNA特異性地復(fù)制，然后通過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)，會(huì)跑出條帶出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。反之當(dāng)沒(méi)有支原體污染時(shí)，由于沒(méi)有模板，PCR無(wú)法擴(kuò)增，則瓊脂糖電泳跑不出條帶，出現(xiàn)陰性結(jié)果。
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
3個(gè)樣本的支原體檢測(cè)，分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照Pc: Positive control,陰性對(duì)照Nc: Negative control，待測(cè)樣本1， 2， 3。
常見(jiàn)問(wèn)題
1、取待檢樣本：
一般是接種后進(jìn)行 3-6d細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液；
如果使用 Eagle 等常用的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)上清可直接加入到 PCR 反應(yīng)液中；
如果使用細(xì)胞懸濁液作為樣品，則需要提取 DNA，再進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。
2、一定要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（一般采用帶有支原體特異片段的質(zhì)粒）與陰性對(duì)照（H2O）；
3、配制PCR反應(yīng)體系時(shí)需在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，避免污染。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過(guò)量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過(guò) 10μm，2~8 張，表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說(shuō)明書(shū)要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說(shuō)明書(shū)。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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